- Приготовление суспензии эритроцитов. Эритроциты барана в растворе Олсвера (1:1) трижды отмывают edta-gvb и готовят 5% суспензию в gvb2^ К 0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов добавляют 1,4 мл дистиллированной воды, после лизиса эритроцитов измеряют ods4i против дистиллированной воды. Необходимой концентрации эритроцитов барана 1х109 кл/мл соответствует 0d541 0,680 при длине оптического пути 1 см. Если 5 % суспензия не дает необходимого значения od541, значит ее необходимо развести (если od541<0,680) или сконцентрировать (если od541>0,680) во столько раз, во сколько полученное ods4i отличается от 0,680.
- Подбор разведения гемолизина для оптимальной сенсибилизации эритроцитов. Готовят серийные двукратные разведения гемолизина (используют гемолизин с титром 1:1500 и выше) на gvb2'. Берут 2-4 ряда пробирок. В каждый ряд вносят по 0,1 мл/пробирку приготовленные разведения гемолизина. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Встряхивают и инкубируют при 25° С 20 мин. Готовят несколько разведении комплемента на gvb24 - на каждый ряд свое разведение. Величина разведения зависит от вида рыб и активности комплемента (1:15 - 1:80). В каждую пробирку ряда вносят по 1,3 мл комплемента одного и того же разведения. Инкубируют 60 мин при 25° С (для кар- па), 120 мин при 20° С (для лососевых), 120 мин при 25° С (для тиляпии), периодически встряхивая. Центрифугируют 5 мин при 16ДО g, определяют od541 и рассчитывают процент гемолиза супернатанта для каждой пробирки. Для каждого разведения комплемента строят график зависимости процента гемолиза от разведения гемолизина. Выбирают кривую с таким разведением комплемента, при котором максимальный гемолиз составляет 50-70% (т.е. кривая выходит на плато при гемолизе 50-70%). За оптимальное разведение гемолизнна принимают максимальное разведение, вызывающее максимальный % гемолиза (выход кривой на плато) и для надежности это разведение уменьшают в 2 раза (например, кривая выходит на плато при разведении гемолизина 1:800, а за оптимальное принимают разведение 1:400).
- Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. Готовят оптимальное разведение гемолизина в edta-gvb. Это разведение медленно добавляют (при постоянном помешивании) к равному объему суспензии эритроцитов (1х109 кл/мл в edta-gvb) и инкубируют 30 мин при 25° С. Сенсибилизированные эритроциты отмывают в ggvb2^, центрифугируют 5-10 мин при 500g и готовят суспензию эритроцитов в ggvb^ с концентрацией 5х108 кл/мл. Концентрацию эритроцитов контролируют, измеряя ods4i лизированных клеток (0,2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды дают ods4i, равную 0,680). Сенсибилизированные эритроциты хранят при +4° С в течение 1 недели. - Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент разводят gvb24 в зависимости от предполагаемой его активности, чтобы попасть в область 50% лизиса (для карпа обычно 1/40 - 1/60, для лососевых - 1/60 - 1/80). Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного испытуемого комплемента (0,4; 0.5; 0.6; 0.8; 1.0 мл), gvb21 доводят объем до 1,3 мл, в каждую пробирку добавляют по 0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов. Три пробирки используют для контролей: 1 -контроль эритроцитов на спонтанный лизис (0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл gvb^); 2 - 100% лизис эритроцитов (0.2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл дистиллированной воды); 3 - контроль od.541 комплемента (1.0 мл разведенного комплемента + 0.5 мл gvb^).
Пробирки инкубируют, периодически встряхивая (время и температура - оптимальные для каждого вида рыб). Центрифугируют 5 мин при 1600g. Измеряют od541 супернатанта. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на контроли. Т.е. от полученного значения od.,41 супернатанта каждой опытной пробирки вычитают od.s4i контроля эритроцитов и ods4i контроля комплемента (значение ods^i контроля комплемента измеряют только для первой пробирки, в которой максимальный объем комплемента, а для остальных пробирок эта величина уменьшается пропорционально уменьшению объема комплемента).
В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/(1 - у) от объема комплемента. При 50% гемолизе у/(1 - у) = 1. Графически находят объем комплемента (К), вызывающий 50% гемолиз, что соответствует 1 гемолитической единице chso Количество СН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:
М = 0.2 n : К,
где: n - величина, обратная разведению комплемента; 0.2 - коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 5 раз меньше (1.5 мл), чем в оригинальном по Мейсру (7.5 мл). Гемолитическая активность комплемента карпа равна 20.0 ± 9.1, радужнойфорели - 28.0 ± 13.5, тиляпии - 205.1 ± 76.6. (t.yano, 1992).
2.2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента по альтернативному пути активации (по yano Т., 1992).
Для определения активности комплемента по альтернативному пути обычно используют эритроциты кролика, как активатор и тест-объект. Реакцию ведут в присутствии egta (хелатньш агент для Са2^ чтобы блокировать классический путь активации) и mg2+.
Гемолитическая активность карпа (в отличие от радужной форели, тиляпии, аю, порги, ' желтохвоста, человека, свиньи) возрастает в несколько десятков раз при добавлении в реакционную смесь 0.1 mm ca2^ - Принцип метода основан на способности комплемента активироваться эритроцитами кролика и лизировать их. За единицу активности комплемента (АСН5о) принимают такое количество неразведенной сыворотки, которое вызывает 50% лизис 4х10 эритроцитов при 20°С в желатин-вероналовом буфере, содержащем 10mМ egta и 10mm mg^ в объеме 0.7 мл; рН и время инкубации различаются в зависимости от вида рыб (радужная форель - рН 7.0, 1.5 часа; карп - рН 7.5, 1.5 часа). - Оборудование и реактивы; оборудование см. п. 2.2.2.1.; глюкоза; дистилированная вода; Ма-5,5-диэтилбарбитурат; mgcl2+2; in hc1; egta; желатин; naoh; эритроциты кролика; сыворотка крови рыб (источник комплемента).
- Приготовление буферных растворов:
- Всроналовый буфер, концентрат (5 vb), см.п, 2.2.2.1. - 0,1 М egta - mg буфер,: egta - 38 r, mgc12 x 6 Н20 - 20,3 г, naoh – 7 r, дистилированная вода - 1л, доводят рН до 7,5 in naoh. - 0,01 М egta - mg желатин-вероналовый буфер (egta-mg-gvb): жедатин-0,1 г; 5 vb-20 мл; 0,1 М egta-mg-10 мл; дистилированная вода до 100 мл, доводят рН до 7,5 (для карпа), до 7,0 (для радужной форели). Хранят при +4° С в течение 1 недели.
- Приготовление суспензии эритроцитов кролика. Эритроциты кролика в растворе Олсвера (1:1) отмывают трижды в egta-mg-gvb и готовят суспензию с концентрацией 2х108 кл/мл в этом же буфере. Концентрацию эритроцитов контролируют, измеряя odw лизированных клеток (к 0,1 мл суспензии эритроцитов добавляют 3,4 мл дистиллированной воды и измеряют od4i4 лизата; если полученная величина od4i4 отличается от 0,740, то суспензию эритроцитов необходимо развести или сконцентрировать во столько раз во сколько полученное 00414 отличается от 0,740).
-Получение и условия хранения комплемента см.п.2.2.2.1. -Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент разводят в egta-mg-gvb в зависимости от вида рыб и предполагаемой активности (для карпа 1/15 - 1/20, радужной форели 1/100 -1/170). Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные-объемы разведенного комплемента (0,1; 0,125; 0,160; 0,20; 0,25 мл), доводят общий объем до 0,25 мл egta-mg-gvb и добавляют в каждую пробирку по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Три пробирки используют для контролей: 1-контроль эритроцитов на спонтанный лизис (0,25 мл egta-mg-gvb + 0,1 мл суспензии эритроцитов); 2 - 100 % лизис (0,1 мл суспензии эритроцитов + 3,4 мл дистиллированной воды); 3 - контроль комплемента (0,25 мл разведенного комплемента + 0,1 мл egta-mg-gvb). Пробирки инкубируют 90 мин при 20° С (для карпа, радужной форели), периодически встряхивают.
В каждую пробирку (кроме 2-го контроля) добавляют по 3,15 мл egta-mg- gvb и центрифугируют 5 мин. при 1600g. Измеряют od4i4. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на контроль эритроцитов и комплемента (см.п.2.2.2.1.). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/1-у от объема комплемента. При 50 % гемолизе у/(1-у)=1. Графически находят объем комплемента (К), вызывающий 50 %-ньш гсмолиз, что соответствует одной гемолитической единице АСН5и. Количество АСН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:
М = 0,5 n : К,
где: n-величина обратная разведению комплемента, 0,5- коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 2 раза меньше, чем в оригинальном. По данным yano Т., 1992, гемолитическая активность комплемента карпа равна 58,9 j: 13,5, радужной форели - 345 +_ 108, тидяпии- 574 j: 250, барана - 15,4, морской свинки - 11,9, собаки -14,4, человека -18,4.
2.2.3. Определение активности иптерферона спектрофотометри-ческим методом (t.renault et al. 1991, с дополнением)
Разработано несколько методов определения активности интерфе-рона, основанных на его способности ингибировать ЦПД вируса в культуре клеток, снижать число бляшек в ней, подавлять титр вируса и синтез РНК. Титром интерферона считают наибольшее разведение испытуемого материала, уменьшающее на 50% показатель активности вируса в контроле. При исследовании большого количества образцов часто используют микрометод титрования интерферона в культуре клеток. При этом очень важно выбрать соответствующую систему "культура клеток - вирус". Вирус должен иметь высокую чувствительность к интерферону и вызывать в культуре клеток четкие изменения, приводящие к разрушению монослоя. Используют культуру клеток гомологичную интерферону и высоко чувствительную к его защитному действию. Для титрования интерферона лососевых рыб наиболее распространенной является система: rtg-2-ipnv; ддя карпа - ЕРС- svcv. В качестве источника интерферона используют сыворотки рыб, в случае исследования мальков - го-могенат тушек рыб.
2.2.3.1. Принцип метода. Спектрофотометрический микрометод титрования интерферона основан на различии оптической плотности ин-тактного клеточного монослоя и монослоя с признаками ЦПД после окрашивания соответствующими красителями. За единицу активности интерферона принимают такое разведение образца, которое защищает 50% клеточного монослоя, то есть оптическая плотность клеточного монослоя, обработанного этим разведением, равна 50% оптической плотности контрольного неинфицированного монослоя.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
