МИНИСТЕРСТВО УТВЕРЖДАЮ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Заместитель руководителя РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии (Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ В.В. Селиверстов
107139, Москва, Орликов пер., 1/11 Для телеграмм: Москва, 84 Минсельхозпрод Телекс: 41773К ЛЕН Телефоны: 975-58-50; 975-54-23 № 13-4-2-/1795 от 25.11.99
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ио определению уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб
1. Общие положения
Естественная рсзистентность рыб - это врожденная способность организма противостоять агрессивному влиянию патогенных факторов биотической и абиотической природы, в том числе, возбудителям инспекционных и инвазионных болезней и продуктов их жизнедеятельности (экзо- и эндотоксинам). Иммунный статус - это структурно-функциональное состояние иммунной системы в конкретный момент жизни особи. Иммунная система рыб представляет собой совокупность клеточных и гуморальных факторов иммунитета и состоит из клеток лимфоидно-макрофагального комплекса (лимфоцитов, гранулоцитов, клеток Купфера, Лангерганса и т.д.) и гуморальных компонентов (иммуноглобулины, система компонентов комплемента, лизоцим, С-рсактивныс белки, интерферон, лизины, гемолизины, гемагглютинины и т.п.). Клеточные элементы иммунной системы организованы в тканевые и органные структуры. К ним относятся: тимус, селезенка, печень, лимфоидная ткань головного и туловищного отделов почек, скопления лимфоидной ткани черепной коробки, кишечника, перикарда, Лейдигова и эпигональных органов. Лейдигов и эпигональные органы встречаются только у хрящевых, а скопления лимфоидно-миелоидной ткани в черепной коробке у хрящевых и костных ганоидов. Значительная часть иммунокомпстентных клеток является составной частью крови и лимфы. Иммунная система рыб отличается от таковой высших позвоночных отсутствием лимфатических узлов, костного мозга и фабрициевой сумки (как это имеет место у птиц); иммуноглобулины у рыб представлены, только igm подобными антителами, тогда как у теплокровных - 5 классами (igg, igm, iga, igd, ige).
Для оценки естественной резистентности организмов рыб к заразным болезням, используют разнообразные методические приемы анализа структурно- функционального состояния иммунной системы. Они основаны на регистрации показателей специфических и неспецифичсских факторов клеточного и гуморального иммунитета.
2. Неспецифические факторы иммунитета Неспецифические факторы иммунитета участвуют в реализации функций защиты организма рыб от чужеродных тел, независимо от специфических факторов, являются естественными или врожденными компонентами организма рыб и не возникают вновь при встрече с чужеродными телами. В зависимости от структурной организации их компонентов подразделяются на клеточные и гуморальные.
2.1. Клеточные факторы
В организме рыб они представлены разнообразными по структурной организации клетками: лейкоцитами, макрофагами, эндотелиоцитами и т.д. Одной из основных функций этих клеток является (фагоцитоз. Кроме того, они участвуют в синтезе медиаторов иммунного ответа и антибиотических веществ: лизоцима, интерферона, агглютининов, интерлсйки-нов и др.
2.1.1. Лейкоциты
Лейкоциты рыб представлены разнообразными по структуре и характеру выполняемой функции клетками: лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, эозино- и базофилами. В основном, лейкоциты рыб, в отличие от высших позвоночных, представлены лимфоцитами, тогда как у теплокровных - клетками нейтрофильного ряда. У рыб на долю лимфоцитов приходится 45-99 % клеток от общего числа лейкоцитов, а у высших позвоночных-25-30%. В 1 мл крови рыб лейкоцитов содержится в 5-10 и более раз больше, чем у человека и животных. Количество лейкоцитов и отдельных типов клеток, его составляющих, в организме рыб колеблется и зависит от индивидуальных, возрастных особенностей, сезона года, зараженности их паразитами, присутствия в воде токсических факторов и условий содержания. На воздействие благоприятных и неблагоприятных факторов рыбы реагируют интенсивностью лейкопоэза и изменением соотношения между лимфоцитами и гранулоцитами. В организме рыб, подвергнутых воздействию "агрессивных" факторов, увеличивается доля содержания клеток гранулоцитарного ряда (палочкоядерных, ссг-ментоядерных нейтрофилов и эозинофилов и аберрантных форм клеток).
Изменения в составе лейкоцитов отражаются на степени сопротивляемости рыб к инфекционным и инвазионным болезням. Снижение содержания лимфоцитов отражается на интенсивности синтеза антител, отторжения трансплантата, завершенности фагоцитоза и напряженности иммунитета к болезням. Существуют прямой и непрямой способы учета общего числа лейкоцитов в крови рыб. Исследования проводят в соответствии с "Методическими указаниями по проведению гематологического обследования рыб", утвержденными Департаментом ветеринарии 02.02.99 г., № 13-4-2/1738.
2.1.2. Фагоцитоз
Функциональное состояние фагоцитов в большинстве случаев определяется по фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови или клеток, выделенных из головного, туловищного отделов почек и селезенки. Существуют разнообразные методические приемы количественной оценки фагоцитарной активности лейкоцитов. Одни основаны на подсчете числа фагоцитов с захваченными чужеродными телами под микроскопом, другие - на регистрации интенсивности проявления кислородзависимой антиинфекционной системы в реакции хемилюминесцснции или по способности фагоцитов восстанавливать растворимый краситель нитросиний тетразолий в нерастворимый диформазан (НСТ-тест). Определение фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro и in vivo в отношении микроорганизмов основано на учете фагоцитов под световым микроскопом. Хсмилюминесцентный метод определения фагоцитарной активности клеток требует специального дорогостоящего оборудования и компьютерной техники. Способ определения фагоцитарной реакции лейкоцитов по НСТ-тесту более трудоемкий, чем основанный на использовании тест- микроорганизмов. Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов в отношении микробов в практике лабораторных исследований чаще всего проводится in vitro и in vivo. В качестве тест-микробов рекомендуется использовать грамположителъные и грамотри-цательные микробы: staphilococcus aureus, acromonas hydrophila и saccharomyces cerevisiae.
2.1.2.1. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro по Е.А. Коста и М.И. Стенко (1947).
Принцип метода. Указанный метод основан на учете соотношения числа лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе, и общего числа клеток белой крови. - Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; пипетки стерильные на 1,0 мл; пастеровские пипетки стерильные; 0,65%-ный стерильный раствор натрия хлорида; 2%-ный стерильный раствор натрия цитрата; водяная баня, отрегулированная на 60°С; объект фагоцитоза -одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий a. hydrophila, инактивированных при 60°С в течение 30 минут, приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат отрегулированный на 26°С; предметные стекла; шли4юваннос стекло; набор для окраски мазков крови; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром ]: 1; рабочий раствор красителя азур-эозина; иммерсионное масло; микроскоп. - Материал для исследования, ход определения и учет результатов. В пробирку вносят 0,1 мл 2%-ного стерильного раствора натрия цитрата, (,|,2 мл свсжевзятой крови от обследуемой рыбы, 0,2 мл объекта фагоцитоза. Взвесь осторожно, но тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 26°С (для теплолюбивых рыб) и более низкой (для холодолюбивых). Через 15 и 30 минут, 1; 1,5 и 2 часа с момента тер-мостатирования пастеровской пипеткой забирают смесь из пробирки, помещают на предметное стекло и делают мазки, которые фиксируют в течение 10 мин. смесью спирта с эфиром (1:1) или в течение 5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в течение 20-40 мин. рабочим рас- твором азур-эозина. После этого их просматривают под иммерсией (ок.7.x об.90). Подсчитывают 100 (иногда 50) лейкоцитов. Захватывающую способность лейкоцитов выражают двумя показателями: процентом фагоцитоза - процентным отношением лейкоцитов, захвативших тест-микробы, к общему числу подсчитанных, и фагоцитарным индексом - количеством тест-микробов, захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом.
2.1.2.2. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов in vivo по Г.Д.Гончарову (1966) - Принцип метода заключается в исследовании реакции фагоцитоза лейкоцитов в брюшной полости рыб. Анализ фагоцитарной реакции, проводится через 15, 30, 60, 90 и 120 мин, с момента введения микроорганизмов - Оборудование и реактивы: шприц и инъекционные иглы; 0.65%-ный стерильный раствор натрия хлорида; водяная баня, отрегулированная на 60°С; одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий А. hydrophila, инактивированной при 60°С в течение 30 мин.; термостат, отрегулированный на 26°С; пастеровские пипетки стерильные; предметные стекла; шлифованное стекло; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром 1:1; рабочий раствор азур- эозина; иммерсионное масло; микроскоп.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
